初级纤毛（Primary cilia）是一种突出于细胞表面的“天线样”细胞器，通过调节Hedgehog、WNT、受体酪氨酸激酶（RTK）、Notch及Hippo等众多信号通路的激活和信号传递在细胞感应多种信号刺激进程中发挥关键作用，其结构和功能异常会引发多种疾病［1］。初级纤毛与细胞周期之间存在密切的相互调控关系，大部分类型实体瘤因细胞周期失控往往纤毛发生率维持在极低水平，甚至是完全缺失初级纤毛［2］。近期研究发现，电离辐射（Ionizing radiation，IR）不仅能够诱导人成肌细胞等正常细胞的纤毛发生［3-5］，而且同样影响肿瘤细胞的纤毛发生［6］，并且初级纤毛可能参与调节肿瘤细胞的放化疗敏感性［7-9］。在前期工作中［10］，我们发现来源于同一个神经胶质瘤患者瘤体组织的两种细胞系M059K和M059J不仅辐射敏感性存在巨大差异，M059K细胞对X射线的敏感性约为M059J细胞的1/14，而且X射线照射后纤毛发生情况也不相同，M059K细胞的纤毛发生率随照射剂量的增加逐渐升高而M059J细胞的基本无变化，表明初级纤毛可能对细胞的辐射敏感性具有重要的调节作用。然而，两种细胞在IR照射后初级纤毛发生情况不同的原因仍不清楚。本研究初步探索了自噬参与调节IR诱导M059K和M059J细胞初级纤毛发生的生物学功能。1 材料与方法1.1　 材料M059K和M059J细胞购自ATCC，本实验室保存。Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）/F-12液体培养基购自Gibco，胎牛血清（FBS）购自Biological Industries，双抗（青霉素和硫酸链霉素，100×）购自Sigma。Arl13b（ADP ribosylation factor-like 13b）单克隆抗体购自Proteintech，γ-tubulin（γ-Tub）单克隆抗体购自Sigma，荧光二抗（Alexa Fluor 594和Alexa Fluor 488）购自ThermoFisher。细胞自噬抑制剂氯喹（Chloroquine，CQ）和自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）购自MCE，二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）购自Sigma。自噬标志蛋白LC3单克隆抗体购自Abcam，自噬标志蛋白p62/SQSTM1（p62）、内参GAPDH单克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自Proteintech，RIPA（Radio immunoprecipitation assay）购自上海碧云天生物技术有限公司，HRP底物化学发光液购自Merck Millipore。1.2　 细胞培养及处理细胞使用DMEM/F-12完全培养基（含10% FBS和1%双抗）培养于5% CO2、37 ℃恒温细胞培养箱。使用不含FBS的培养基对细胞进行血清饥饿（Serum starvation，SS）处理，使用CQ（5 μmol/L）或RAPA（10 μmol/L）抑制或激活细胞自噬。1.3　 细胞X射线照射利用PXI Precision X-RAY225照射系统对指数生长期细胞进行X射线（X-ray）辐照，系统管电压为225 kV，管电流为13.3 mA，剂量率为2 Gy/min。1.4　 初级纤毛免疫荧光检测通过对特异定位于初级纤毛膜上的Arl13b和中心粒结构蛋白γ-Tub进行免疫荧光染色指征初级纤毛和基体［11］，免疫荧光染色实验具体步骤参考前期工作［10］。实验流程概述：细胞经X射线照射或SS处理0 d、1 d、3 d后进行固定、透膜和封闭，之后用Arl13b（1∶500稀释）和γ-Tub（1∶500稀释）单克隆抗体室温孵育2 h，Alexa Fluor荧光二抗（1∶1 000）室温避光孵育2 h，最后使用DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）复染并封片。利用ECHO荧光显微成像系统（RVL-100-G）采集荧光图片，通过ImageJ软件进行初级纤毛发生率统计，随机选取10个以上视野进行分析。1.5　 蛋白质免疫印迹细胞经RIPA裂解后离心收集总蛋白并加热变性，通过SDS-PAGE凝胶进行蛋白质电泳分离，将凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜，室温封闭2 h，p62（1∶1 000稀释）和GAPDH（1∶5 000稀释）单克隆抗体室温孵育2 h，HRP标记的二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h，利用HRP底物化学发光液进行显影并使用Alliance LD4凝胶成像系统采集图像，使用ImageJ软件对蛋白条带灰度值进行分析。1.6　 LC3免疫荧光染色自噬体中LC3的存在以及转化成LC3-II是自噬发生的标志［12］。通过对LC3进行免疫荧光染色检测细胞自噬水平。冰甲醇固定细胞10 min，0.5% Triton X-100溶液透膜5 min，5%山羊血清封闭2 h，之后用LC3（1∶500稀释）单克隆抗体室温孵育2 h，Alexa Fluor 488荧光二抗（1∶500稀释）室温避光孵育2 h后用DAPI进行复染并封片。使用ECHO荧光显微成像系统采集图片，并使用ImageJ对荧光图片进行量化统计，随机统计5个以上视野中的细胞进行分析。1.7　 统计学分析所有实验进行3次以上独立重复，统计数据采用“平均数±标准差”（x¯±s）表示并通过Student's-t检验进行样本间差异显著性分析，* p0.05为差异显著，** p0.01及*** p0.001为差异极显著。2 结果与分析2.1　 X射线照射对M059K和M059J细胞初级纤毛发生的影响前期工作发现，M059K和M059J细胞经0~10 Gy X射线照射1 d后，M059K细胞中纤毛细胞比例显著上调，且随着照射剂量的增加上调比例越高，而M059J细胞中纤毛细胞比例无明显变化［10］。在本研究中，首先对两种细胞照射10 Gy X射线，并在辐照后3 d进一步检测初级纤毛的发生情况。结果如图1所示，在X射线照射3 d时M059K细胞纤毛发生率由对照组（43.6±3.4）%上升至（77.9±5.2）%（p0.01）；而M059J细胞的纤毛发生率在对照组和照射组中分别为（6.5±0.6）%和（6.7±0.8）%，并无显著差异。此外，X射线照射还引起了M059K细胞中多纤毛细胞（≥2个纤毛）比例的上升（图1(a)），这与前期研究结果一致［10］。综上所述，这些结果进一步表明X射线照射仅能够促进M059K细胞纤毛发生而不能诱导M059J细胞纤毛发生。10.11889/j.1000-3436.2023-0104.F001图1X射线照射及未照射的M059K和M059J初级纤毛检测：（a） M059K细胞未照射组（Ctrl）和10 Gy X射线照射3 d组（10 Gy-3 d）初级纤毛荧光图像及（b）纤毛发生率统计；（c）M059J细胞Ctrl组和10Gy-3d处理组初级纤毛荧光图像及（d）发生率统计； Arl13b（红色，白色箭头标示）指示初级纤毛，γ-Tub（绿色）指示基体，DAPI（蓝色）指示细胞核，标尺10 μm；ns为差异不显著，**p0.01，10 Gy-3 d vs. Ctrl （彩色见网络版）Fig.1Immunofluorescence staining of primary cilia in M059K and M059J cells exposed to X-ray: (a) immunofluorescence pictures of primary cilia in M059K cells treated with 10 Gy of X-rays at 3 d post-irradiation (10 Gy-3 d) or non-irradiated (Ctrl); (b) the proportion of ciliated cells in (a); (c) immunofluorescence pictures of primary cilia in Ctrl or 10 Gy-3 d M059J cells; (d) the proportion of ciliated cells in (c); primary cilia and basal bodies were stained for Arl13b (red, white arrows indicated) and γ-Tub (green), respectively; the nuclei were stained with DAPI (blue); scale bar, 10 μm. ns, not significant; **p0.01, 10 Gy-3 d vs. Ctrl (color online)2.2　 血清饥饿处理诱导M059K和M059J细胞初级纤毛发生由于X射线照射后M059J细胞的纤毛发生没有产生变化，为了明确是该细胞的纤毛发生能力异常还是IR不能刺激该细胞纤毛发生，选择诱导纤毛发生的经典方法-血清饥饿胁迫对M059K和M059J进行处理。结果显示，M059K细胞的纤毛发生率由正常条件培养（Ctrl）时的（38.4±5.0）%上升至血清饥饿3 d（SS-3d）时的（80.1±8.1）%（p0.01）（图2(a)和(b)），而M059J细胞在血清饥饿处理3 d后纤毛发生率由（6.3±1.2）%（Ctrl）上升至（50.8±3.8）%（SS-3d）（图2(c)和(d)），差异同样极显著（p0.01）。因此，以上数据表明，M059J细胞具有正常的纤毛发生能力，推测X射线照射并不能激活该细胞的纤毛发生进程。图2血清饥饿处理的M059K和M059J细胞初级纤毛检测：（a） M059K细胞经血清饥饿3 d（SS-3 d）和正常条件培养（Ctrl）初级纤毛荧光图像及（b）发生率统计；（c）M059J细胞经血清饥饿3 d（SS-3 d）和正常条件培养（Ctrl）初级纤毛荧光图像及（d）发生率统计； Arl13b（红色，白色箭头标示）指示初级纤毛，γ-Tub（绿色）指示基体，DAPI（蓝色）指示细胞核，标尺10 μm； **p0.01，SS-3 d vs. Ctrl （彩色见网络版）Fig.2Immunofluorescence staining of primary cilia in M059K and M059J cells treated with serum starvation: (a) immunofluorescence pictures of primary cilia in M059K cells starved for 3 d (SS-3 d) or normal condition (Ctrl); (b) the proportion of ciliated cells in (a); (c) immunofluorescence pictures of the primary cilia in Ctrl or 3 d (SS-3 d) M059J cells; (d) the proportion of ciliated cells in (c); primary cilia and basal bodies were stained for Arl13b (red, white arrows indicated) and γ-Tub (green), respectively; the nuclei were stained with DAPI (blue); scale bar, 10 μm. **p0.01, SS-3 d vs. Ctrl (color online)10.11889/j.1000-3436.2023-0104.F2a110.11889/j.1000-3436.2023-0104.F2a2 2.3　 X射线照射对M059K和M059J细胞自噬的激活效应不同自噬是介导血清饥饿胁迫刺激初级纤毛发生的关键细胞进程［13］，提示M059K和M059J细胞在受到IR照射后自噬激活水平可能存在差异（图3）。10.11889/j.1000-3436.2023-0104.F003图3X射线照射或血清饥饿处理的M059K和M059J细胞自噬水平检测：（a） M059K和M059J细胞经血清饥饿3 d（SS）、10 Gy X射线照射后3 d（10 Gy）或正常条件培养（Ctrl），免疫荧光染色检测LC3（绿色）指征自噬体，DAPI（蓝色）表示细胞核；（b） SS和10 Gy组细胞中LC3荧光强度相对于Ctrl组的变化率统计；（c） 蛋白质免疫印迹法检测M059K和M059J在血清饥饿3 d后细胞内p62表达水平及数据统计；（d） 蛋白质免疫印迹法检测M059K和M059J在10 Gy X射线照射3 d后细胞内p62表达水平及数据统计；*p0.05，SS-3 d vs. Ctrl或10 Gy-3 d vs. Ctrl （彩色见网络版）Fig.3Assessment of autophagy levels in M059K and M059J cells treated with X-ray or serum starvation: (a) representative immunofluorescence images of LC3 in M059K and M059J cells treated with serum starvation for 3 d (SS-3 d), 10 Gy of X-rays at 3 d post-irradiation (10 Gy-3 d), or normal culture condition (Ctrl); autophagosomes were stained for LC3 (green) and the nuclei were stained with DAPI (blue), scale bar, 10 μm; (b) the relative fluorescence intensity of LC3 (vs. Ctrl) in M059K and M059J cells in (a); (c) immunoblotting analysis of the protein expression levels of p62 in M059K and M059J Ctrl cells or SS-3 d cells; (d) immunoblotting analysis of the protein expression levels of p62 in M059K and M059J Ctrl cells or 10 Gy-3 d cells; GAPDH was used as a loading control. ns, not significant, *p0.05, SS-3 d or 10 Gy-3 d vs. Ctrl (color online)结果显示，当两种细胞进行血清饥饿处理时，细胞内自噬体数量急剧增加（图3(a)和(b)），且p62蛋白表达水平显著降低（图3(c)），表明细胞内自噬的基础水平较高。当细胞受到X射线照射后，在M059K细胞中观察到自噬体数量增加（图3(a)和(b)）和p62蛋白水平的降低（图3(d)），表明IR能够在M059K细胞中激活自噬。然而，受照射的M059J细胞中自噬体数量和p62蛋白水平变化不明显（图3(a)、(b)和(d)），表明X射线照射并未有效诱导M059J细胞发生自噬，同时也提示自噬的激活与否可能参与调控IR照射是否能够启动胶质瘤细胞的初级纤毛发生进程。2.4　 RAPA激活自噬引起M059K和M059J细胞初级纤毛发生为了确定自噬是否与神经胶质瘤细胞初级纤毛发生相关，利用自噬激动剂RAPA处理M059K和M059J细胞后检测纤毛发生水平变化（图4）。10.11889/j.1000-3436.2023-0104.F004图4RAPA处理的M059K和M059J细胞初级纤毛检测：（a） 蛋白质免疫印迹法检测M059K和M059J细胞在RAPA处理3 d后细胞内p62表达水平及（b）数据统计；（c） M059K和M059J细胞在RAPA处理3 d时初级纤毛荧光图像及（d）发生率统计；Arl13b（红色，白色箭头标示）指示初级纤毛，γ-Tub（绿色）指示基体，DAPI（蓝色）指示细胞核，标尺10 μm。*p0.05，**p0.01，RAPA-3d vs. DMSO （彩色见网络版）Fig.4Detection of the primary cilia in M059K and M059J cells treated with RAPA: (a) immunoblotting analysis of the protein expression levels of p62 in M059K and M059J treated with DMSO or RAPA for 3 d; (b) the relative expression levels of p62 in cells in (a); (c) immunofluorescence pictures of primary cilia in M059K and M059J cells administrated with DMSO or RAPA for 3 d. Primary cilia and basal bodies were stained for Arl13b (red, white arrows indicated) and γ-Tub (green), respectively; the nuclei were stained with DAPI (blue), scale bar 10 μm; (d) the proportion of ciliated cells in cells in (c); *p0.05 and **p0.01, RAPA-3d vs. DMSO (color online)结果显示，两种细胞在经过RAPA处理3 d后胞内p62蛋白水平显著降低（图4(a)和(b)），表明胞内自噬的基础水平较高。同时，两种细胞经RAPA处理3 d后纤毛发生率均上升1倍以上（图4(c)和(d)），其中M059K纤毛发生率由DMSO处理组的（35.4±8.8）%升至RAPA处理组的（78.2±7.5）%（p0.01），M059J纤毛发生率由DMSO组的（8.1±1.2）%升至RAPA组的（20.8±2.6）%（p0.05）。因此，这些结果证明，在M059K和M059J细胞中激活自噬能够引起初级纤毛发生，提示自噬参与调控细胞的纤毛发生进程。2.5　 抑制自噬降低X射线照射诱导的M059K细胞初级纤毛发生为了进一步明确自噬是否参与调节IR引起的神经胶质瘤细胞初级纤毛发生，M059K细胞在进行10 Gy X射线照射后即刻给与自噬抑制剂CQ处理，在CQ处理3 d时进行初级纤毛检测。结果显示，CQ处理组细胞内p62蛋白表达水平显著高于DMSO处理组（图5(a)），表明胞内自噬的基础水平较低。同时，初级纤毛检测结果显示（图5(b)），CQ处理组初级纤毛发生率（52.9±6.8）%较DMSO处理组（78.7±6.0）%约下降35%（p0.05）。此外，在M059J细胞中CQ同样能够抑制血清饥饿引起的初级纤毛发生，M059J经血清饥饿联合CQ处理3 d时的纤毛发生率（32.7±5.4）%较DMSO联合处理组（48.5±2.2）%约下降32%（p0.05）。因此，以上结果表明，抑制自噬能够降低IR和血清饥饿引起的神经胶质瘤细胞初级纤毛发生。10.11889/j.1000-3436.2023-0104.F005图5CQ联合X射线照射处理的M059K和CQ联合血清接处理的M059J细胞初级纤毛检测：（a） 蛋白质免疫印迹法检测经10 Gy X射线照射的M059K细胞在CQ处理3 d后细胞内p62表达水平及（b）初级纤毛发生率数据统计；（c） 蛋白质免疫印迹法检测M059K细胞血清饥饿联合CQ处理3 d后细胞内p62表达水平及（d）初级纤毛发生率数据统计；*p0.05，**p0.01，CQ vs. DMSOFig.5Detection of the primary cilia in X-ray-irradiated M059K and SS-treated M059J cells co-treated with CQ: (a) immunoblotting analysis of the protein expression levels of p62 in 10 Gy X-ray exposed-M059K cells combined with DMSO or CQ for 3 d; (b) the proportion of ciliated cells in cells in (a); (c) immunoblotting analysis of the protein expression levels of p62 in SS-treated M059J cells combined with DMSO or CQ for 3 d; (d) the proportion of ciliated cells in cells in (c); *p0.05 and **p0.01, CQ vs. DMSO3 讨论IR能够剂量依赖性地促进人成肌细胞C2C12、永生化视网膜色素上皮细胞hTERT-RPE1初级纤毛发生和生长［3-5］，并且在人神经胶质瘤细胞M059K和GS1910中具有类似效应［6，10］。然而，还有研究报道，IR照射并不会引起人胚肺成纤维细胞MRC5的纤毛发生率升高或降低，而是会抑制其纤毛延长的能力［14］。本研究发现，X射线照射同样不会对肿瘤细胞M059J的纤毛发生产生影响（图1(c)和(d)），这些研究表明，IR是否影响初级纤毛发生可能与细胞类型密切相关，但内在机制仍然不清楚。值得关注的是，近期研究证明DNA损伤药物如依托泊苷、顺铂等能够引起体外培养的正常细胞和肿瘤细胞初级纤毛发生和自噬水平升高，而通过小分子抑制剂或敲低自噬基因ATG7的方法抑制细胞的自噬水平能够显著降低DNA损伤药物引起的纤毛发生［15-16］。IR引起的细胞生物学效应主要由辐射对DNA的损伤所致，提示IR照射引起的纤毛发生有可能同样依赖于细胞的自噬水平。在本研究中，对X射线处理的M059K细胞进行CQ处理抑制自噬水平后降低了X射线照射引起的纤毛发生（图5(a)和(b)），因而初步证明了自噬与X射线照射引起的纤毛发生之间存在联系。自噬对初级纤毛发生的调控作用并不是单向的。当细胞处于营养缺乏的应激条件时，AMP依赖的蛋白激酶AMPK被激活并通过抑制mTOR活性激活自噬，进而导致纤毛发生抑制因子OFD1从中心粒微卫星上解离和降解，最终引起初级纤毛发生［13］。此外，血清饥饿引起的选择性自噬还能够通过降解定位于母中心粒上的纤毛发生抑制因子CP110而促进纤毛发生［17］。另一方面，细胞处于营养正常条件下时，生长因子能够通过激活PI3K-AKT信号通路激活mTOR而使细胞自噬保持在较低的基础水平，但是基础自噬能够选择性降解纤毛发生因子IFT20而抑制纤毛形成并引起纤毛变短［18］。因此，自噬在不同条件下可能发挥促进或抑制纤毛发生的双重作用。本研究证实自噬对X射线照射引起的M059K细胞纤毛发生具有正向调控作用，抑制自噬导致纤毛发生降低（图5），M059J细胞在X射线照射后自噬水平无明显升高时初级纤毛发生进程同样无法启动（图1和图3）。更为重要的是，自噬与初级纤毛之间存在着复杂的相互调控关系。研究发现，大量自噬蛋白如ATG家族成员定位在初级纤毛的基体和轴丝上［18］，抑制纤毛将过度激活mTOR通路，导致细胞内基础自噬水平发生降低［19］。此外，巩膜静脉窦细胞的初级纤毛能够感应流体剪切力并磷酸化激活SMAD2和AKT，活化的SMAD2和AKT能够促进LC3、ATG5等自噬相关因子的转录，最终引起细胞自噬水平升高［20］。虽然本研究仅探索了自噬对神经胶质瘤细胞初级纤毛发生的调节作用，但在前期工作中发现通过干扰IFT88基因表达或利用水合氯醛抑制M059K细胞纤毛发生时，IR或化疗药物替莫唑胺引起的细胞内自噬水平升高被降低［6］，推测放化疗引起的胶质瘤细胞自噬激活依赖于初级纤毛结构和功能的完整。本研究发现，在X射线照射的M059J细胞中纤毛发生和自噬水平均未明显变化而在M059K受照射细胞中均显著升高（图1和图3），这些结果也进一步表明在神经胶质瘤细胞中IR照射引起的自噬和初级纤毛发生之间可能存在着相互反馈调控的关系。尽管初级纤毛通过与自噬的相互调控在肿瘤发生和治疗中可能发挥完全相反的生物学功能［21-23］，但其被视为重要的胶质瘤治疗和增敏的潜在作用靶点［24］。初级纤毛自身及纤毛上的Hedgehog、WNT等信号通路能够影响细胞DNA损伤修复、细胞周期、细胞死亡和衰老、干细胞特性等途径影响细胞命运和敏感性［25-26］。然而，初级纤毛作为众多信号通路的调控“开关”，通过干扰纤毛发生基因如IFT88、KIF3等或化学小分子如水合氯醛直接破坏其结构和功能可能会引起多种副作用。因此，研究和揭示初级纤毛调节肿瘤细胞发生和治疗抵抗的分子机制将有助于精准治疗策略的制定和靶向药物的研发。